coprocultura

Coprocultura

Coprocultura reprezinta o tehnica de lucru folosita in clinicile de microbiologie. Este esentiala pentru cultivarea si identificarea agentilor patogeni localizati in intestinul omului.

Examenul de coprocultura este indicat in urmatoarele situatii:

• infectii cu localizare primara enterala si invazie ulterioara
• infectii cu localizare exclusiv enterala sub forma clinica de enterocolite, boala diareica, toxiinfectii alimentare, evoluind sub forma acuta, subacuta, cronica, clinic inaparenta sau simplu portaj.
• Infectii bacteriene ale altor sisteme in care localizarea enterala este accidentala
• Schimbarea structurii florei bacteriene specifice intestinului care poate aparea in unele situatii patologice (colita pseudomembranoasa) sau ca o consecinta a selectiei unui grup de germeni, consecutiv antibioterapiei.

In etiologia acestora, trebuie avute in vedere, in primul rand enterobacteriile patogene pentru care diagnosticul etiologic este obligatoriu si anume:

• infectii cu germeni din grupul Shigella
• infectii cu germeni din grupul Salmonella
• infectii cu germeni din grupul Escherichia, serotipuri enteropatogene

In toxiinfectiile alimentare pot fi avute in vedere si alte grupe de enteropatogeni:
Staphylococus, Yersinia, Vibrio, Aeromonas, Pseudomonas, Bacillus, Clostridium etc.

Datorita faptului ca o mare varietate de microorganisme folosesc calea enterala pentru patrunderea in organism cu consecinte patogenice si clinice, coprocultura este unul din cele mai solicitate examene de laborator.

Actiuni pregatitoare

Prelevarea probelor coprologice
Pentru recoltare se folosesc coprocultoare din material plastic de unica intrebuintare.
Cele mai multe izolari se obtin din scaunul proaspat, emis spontan. Cu ajutorul linguritei sau tijei coprocultorului se preleva portiuni din scaun cu mucus si eventual urme de sange iar cand acestea lipsesc se recolteaza boluri din 2-3 locuri diferite.
Cantitatea necesara este de 3-5g iar daca scaunul este lichid recoltorul trebuie umplut pe
jumatate.
Proba se eticheteaza si se completeaza fisa cu examenul cerut.
La bolnavii cronici, purtatori, persoane spitalizate, scaunul va fi provocat printr-un purgativ salin.
La controlul purtatorilor de bacili tifici prelevarea se va face timp de trei zile consecutiv, dupa
o administrare unica de purgativ.
La bolnavii cu dizenterie bacteriana proba se poate recolta din colonul sigmoid cu sonda
Nelaton nr. 16-18, sterilizata.
Produsul recoltat se suspenda prin spalarea sondei in 2ml solutie fiziologica sterila sau lichid conservant.

Transportul

Prelevatele de materii fecale destinate examenelor microbiologice se transporta la laborator in cel mai scurt timp (2 ore de la prelevare).
Daca acest deziderat nu poate fi asigurat este obligatoriu folosirea mediului de conservare si transport Cary-Blair.
Proba va fi insotita de un buletin in care se va specifica grupul de germeni pentru care se solicita examinarea, evitandu-se termenul general de coprocultura.

Modul de lucru

Proba se insamanteaza ca atare in caz ca scaunul este lichid, preferandu-se portiunile bogate in striuri cu mucus si sange.
In cazul unui scaun consistent se face intai omogenizarea acestuia in mediul de transport in care a fost adus sau in 5-7 ml solutie salina fiziologica tamponata.
Este util sa se verifice pH-ul lichidului conservant in care a fost adusa proba; acest pH nu trebuie sa fie sub 7,0. Prelevatele recoltate cu sondele Nelaton se suspenda in 2-3 ml solutie salina fiziologica tamponata sau se descarca direct in mediul de imbogatire sau crestere. Prelucrarea ulterioara este diferentiata in functie de examenul solicitat (Shigella, Salmonella, etc). Daca nu exista nici o indicatie referioare la examenul cerut laboratorul are obligatia de
a asigura in primul rand diagnosticul pentru enterobacteriile patogene: Salmonella, Shigella
(pentru adulti) si E.coli serotipurile enteropatogene (pentru copii sub 2 ani).
Se va evita incarcarea laboratorului cu solicitari pentru alte grupe de germeni exceptand strict situatiile in care exista o indicatie epidemiologica certa (toxicoze in maternitati, toxiinfectii alimentare de tip toxic, enterita de tip epidemic).
Pentru persoanele sosite din zone endemice de holera sau pentru salariatii hotelurilor si restaurantelor cu trafic international si care prezinta manifestari enterale se va cerceta in plus si vibrionul holeric.
Coprocultura pentru germenii din grupul Shigella
Probele se insamanteaza in mod obligatoriu pe mediu DCLS asigurandu-se o placa de mediu pentru o proba. Dispersia se va face in asa fel incat sa se obtina colonii izolate.
La fiecare sarja de mediu nou preparat se va face controlul de calitate prin insamantarea unor tulpini de Shigella ca atare, precum si in suspensie de materii fecale.
Placile insamantate sunt examinate dupa incubare de 16-20 ore la 37C. In cazul in care culturile nu sunt bine dezvoltate incubarea se prelungeste pana la 48 ore. Coloniile suspecte se repica in mod obligatoriu pe agar MacConkey sau AABTL, agar TSI si mediu MIU.
Se transplanteaza cel putin 3-4 colonii suspecte in sector si 1-2 colonii pe mediile politrope. Insamantarea mediilor politrope se va face pornind de la colonii izolate pentru a nu contamina inoculul cu flora asociata. Concomitent, in eventualitatea unei culturi abundente si aproape monomorfe pe mediile de etalare se va putea executa si aglutinarea cu seruri antishigella.
Mediile pe care s-au facut transplantarile se examineaza dupa 12-18 ore, confruntandu-se aspectul culturii cu cele dezvoltate pe mediile politrope si reexaminand totodata si cultura originala.
Orice cultura care pe mediul TSI nu produce H2S, fermenteaza glucoza (partea dreapta) fara producere de gaze, fermenteaza lactoza si zaharoza fara producere de acid iar pe mediul MIU nu produce ureaza, este imobila si indol variabila este suspecta de a fi Shigella si va fi supusa aglutinarii cu serurile antishigella existente in trusa standard.
Se incepe cu serurile corespunzatoare grupelor B si D, mai frecvent intalnite, si in caz de obtinere a unui rezultat negativ se vor face aglutinari si cu celelalte seruri.
In cazul in care cultura repicata prezinta caracterele biochimice pe mediile politrope caracteristice pentru Shigella si totusi aglutinarea ramane negativa se va reexamina aglutinabilitatea dupa termoinactivare sau a culturii vii cu serul de tip Shigella flexneri 6. In eventualitatea lipsei oricarei aglutinari, in contrast cu spectrul biochimic caracteristic Shigellelor se vor efectua teste biochimice suplimentare, inclusiv ONPG, si in cazul in care acestea corespund genului Shigella, cultura va fi trimisa pentru identificare la laboratorul de referinta din Institutul Cantacuzino.
Toate tulpinile de Shigella izolate vor fi testate pentru sensibilitate la antibiotice si chimioterapice.
Coprocultura pentru germenii grupului Salmonella
Probele recoltate se insamanteaza in mod obligatoriu pe mediu de imbogatire selectiva cu selenit acid de sodiu.
Dupa o incubare de 16 ore se face repicaj pe mediu de DCLS. Daca este posibil se va asocia si o insamantare directa pe acest mediu de izolare.
In suspiciune de febra tifoida se va efectua o insamantare abundenta pe mediu Wilson-Blair. Coloniile suspecte dezvoltate pe mediile de etalare directa sau dupa imbogatire se repica pe
agar MacConkey sau AABTL, in sectoare si in mod obligatoriu pe mediile politrope TSI si MIU.
Incubare 20-48 ore. Pentru mediul Wilson-Blair este obligatoriu incubarea de 48 ore.
Orice colonie care pe mediul TSI produce hidrogen sulfurat, fermenteaza glucoza cu producere de gaze (partea dreapta) si nu produce acid din lactoza-zaharoza iar pe mediul MIU este ureazo-negativa, indol-negativa si mobila este suspectata de a fi Salmonella.
Culturile dezvoltate pe mediul TSI care produc hidrogen sulfurat in cantitati minime sau nu produc deloc, fermenteaza glucoza fara producere de gaze avand celelalte caractere similare cu celelalte mentionate mai sus sunt suspectate de a fi Salmonella typhi. Cu acestea se procedeaza imediat la identificarea serologica.
Culturile dezvoltate pe mediile politrope si pe mediile de repicare in placi vor fi examinate, confruntandu-se cu aspectul culturii initiale. In cazul in care ele prezinta spectrul biochimic caracteristic salmonelelor pe mediile politrope sau culturi suspecte pe repicarile din sector, se va trece la aglutinarea pe lama cu serurile anti-salmonella folosindu-se serurile Poli O si Vi ca etapa screening. In caz pozitiv se vor face aglutinari pe lama cu serurile O de grup (AO,
BO, CO, DO, ) si apoi cu cele flagelare H de tip.
In eventualitatea in care tulpina izolata, desi mobila, nu aglutineaza cu serurile flagelare se
va da rezultatul de grup Salmonella (AO, BO, CO, DO, EO). Acelasi rezultat este recomandabil si in cazul in care tulpina nu poate fi diagnosticata ca un anume serotip: exceptie face Salmonella typhi pentru care diagnosticul de serotip trebuie sa fie realizat in prima etapa.
In cazul aglutinarilor negative cu serul Poli O si Vi, dar in prezenta unui spectru biochimic tipic pentru Salmonella, se vor efectua teste biochimice suplimentare (cercetarea lizin- decarboxilazei si testul ONPG) si se va repeta testarea serologica dupa termo-inactivare.
Tulpina de Salmonella izolata se va trimite la Institutul Cantacuzino pentru identificarea de serotip si eventual lizotip.
Fiecare tulpina de Salmonella izolata va fi testata pentru sensibilitatea la antibiotice si chimioterapie.
Coprocultura pentru E. coli, serotipuri enteropatogene
Proba de scaun se insamanteaza pe agar MacConkey sau mediu AABTL. Dupa incubare la
370C peste noapte se transplanteaza pe aceleasi medii cate 5-10 colonii lactozo-pozitive si se incubeaza 16-20 de ore.
Din cultura obtinuta se procedeaza la aglutinarea pe lama cu ser polivalent anticolibacilar. In cazul unor aglutinari puternice si imediate se vor executa aglutinari pe lama cu seruri monovalente din setul standard de seruri anticolibacilare.
Daca testele biochimice pe mediile politrope TSI si MIU sunt caracteristice pentru grupul ESCHERICHIA, insa aglutinarea cu serurile monovalente este negativa, sau o cultura aglutineaza cu mai multe seruri monovalente, se va proceda la aglutinarea in tuburi cu cultura vie si cultura termoinactivata.
Tulpinile de E. coli izolate apartinand serotipurilor enteropatogene sunt testate pentru sensibilitate la antibiotice si chimioterapice.
Situatii speciale: coprocultura in situatii speciale se face pentru decelarea urmatorilor agenti patogeni:

• vibrion holeric
• stafilococ ( in toxiinfectiile alimentare)
• Yersinia enterocolitica

In aceste cazuri sunt utilizate medii speciale care permit izolarea, precum si seruri specifice pentru confirmare.
Examenul microscopic al probelor coprologice
Acest examen poate duce la decelarea directa a unor agenti patogeni, in special parazitari, existenti in fecale.
Examinarea directa a materialului fecal pe preparat umed (intre lama si lamela), in cazul prelevarii dintr-o zona cu sange sau mucus, dupa adaugarea unei cantitati egale de albastru de metilen Loeffler, este de mare ajutor pentru decelerarea leucocitelor care diferentiaza diversele tipuri ale sindromului diareic.
La microscopia in contrast de faza si in camp intunecat se pot observa in preparatul cald forme curbate si mobile de Campylobacter Examinatorii antrenati care lucreaza in zone endemice pot recunoaste aparitia caracteristica si mobilitatea bacteriei Vibrio cholerae.
La examinarea preparatului uscat si colorat dupa metoda Gram pot fi decelati multi germeni subtiri, in forma de virgula, gramnegativi, indicand o infectie cu Campylobacter (daca a fost exclusa infectia cu Vibrio). In plus, pot fi decelate si celule polimorfonucleare.
Coloratia pentru bacterii acido-rezistente poate fi utilizata pentru decelarea micobacteriilor, a Cryptosporidium spp. si a Isospora spp.

Izolarea si identificarea unei bacterii patogene in proba coprologica examinata confirma fie starea de boala fie de purtator si se comunica urgent celui care a solicitat examenul.
In mod obligatoriu se efectueaza si antibiograma agentului patogen izolat comunicandu-se rezultatul acesteia concomitent cu rezultatul examenului coprologic.
In cazul izolarii unui germen din grupul Vibrio se anunta urgent si organul abilitat pentru aplicarea de masuri (Directia de Politie Sanitara).