celule transformate cu sv40

Cea mai importanta observatie aratata aici este faptul ca modelul fragmentelor de restrictie care contin secvente SV 40 este diferit pentru fiecare din seriile de linii de celule transformate cu SV40 derivate independent din aceeasi linie parentala (BALB/c 3T3). Acest lucru arata ca structura ADN-ului SV40 integrat si/sau localizarea lui in genomul gazda trebuie sa fie diferita in variatele linii transformate. Acest fapt sugereaza la randul sau ca integrarea nu este absolut pozitional-specifica. Nu putem exclude posibilitatea ca exista specificitate cu privire la pozitia de recombinare fie pe genomul viral sau pe genomul gazda, dar datele par sa excluda specificitatea cu privire la ambele pozitii simultan. Aceasta interpretare se bazeaza pe presupunerea, inca netestata, ca rearanjamentele ADN-ului viral (insertii, deletii etc.) nu apar obisnuit nici inainte, nici datorita evenimentului integrarii primare. Ar trebui notat ca datele nu exclud posibilitatea ca integrarea apare la secvente nucleotidice specifice daca mai multe din aceste secvente sunt localizate in diferite pozitii pe genoamele gazda sau virale.

Un cercetator afirma ca ramane inca deschisa problema avantajului pe care il dobindeste un virus tumoral in urma inserarii lui in cromozomul celulei gazda sub forma de provirus. Pare greu de presupus ca inserarea ar fi expresia unui joc al hazardului, intrucit ea este conditionata de existenta unor omologii de secventa nucleotidica intre anumite regiuni ale cromozomului celular si ale celui viral. Incapacitatea noastra de a gasi deocamdata un raspuns la aceasta enigma trebuie judecata insa in corelatie cu faptul ca sintem tot atat de putin edificati si in privinta lizogeniei bacteriene. Nici pe acest taram nu suntem inca in stare sa deslusim vreun avantaj selectiv al starii de profag.

Prin metoda de hibridare a acizilor nucleici s-a constatat ca ADN extras din virusul Polioma, hibrideaza nu numai cu ADN din tumoarea Polioma, ci si cu ADN extras din soarecele normal. Mai mult inca, s-a constatat ca si ADN normal extras de la mai multe specii de animale contine secvente comune cu ADN din Polioma, sugerand ca complementarittea, inseamna secvente polinucleotidice comune cu organismele superioare.

Omologia de secventa dintre ADN viral oncogen, ADN din tumoarea indusa de respectivul ADN si o portiune (o regiune scurta) din ADN normal din diverse specii animale, demonstrata cu tehnica hibridarii acizilor nucleici, atesta fara echivoc originea filogenetica anaeroba (ancestrala) a acestor fractiuni nucleice. Fiind segmente nucleice complementare (omologie de secventa nucleotidica) inseamna ca au un continut informational comun. Aceasta concluzie este perfect valabila si pentru Oncorna (virusul ARN tumoral), deoarece, potrivit dovezilor de laborator, informatia acestuia este transmisa in ADN si integrata in genomul nuclear. Transferul de informatie de la ARN la ADN (sintetizarea moleculei de ADN prin reverstranscriere a ARN) se realizeaza cu ajutorul unei enzime specifice (polimeraza ADN dependenta de ARN sau reverstranscriptaza) si, fapt important de semnalat. Cercetari interioare au aratat ca acest proces s-ar produce si  in celulele normale, mai ales in stadii embrionare ale animalelor sau in organe in curs de regenerare.

In ciclul de viata al virusurilor oncogene se disting, ca si in organizarea genetica a fagilor, doua stadii — unul timpuriu, si celalalt tardiv — la fiecare din ele avand loc evenimente biochimice proprii stadiului respectiv.
De exemplu, la virusul Polioma si SV40 (ambele avand un comportament biologic identic), in stadiul timpuriu se sintetizeaza sub controlul viral cateva proteine al caror rol metabolic exact, nu este inca elucidat. Totusi, s-a demonstrat ca una dintre aceste proteine este intens antigenica (antigenul T) — antigenul specific tumoral — si se acumuleaza in cantitati mari in nucleu. Deoarece atat virusul Polioma, cat si SV40 au proprietatea de a induce sinteza de ADN specific gazdei paralel cu propria multiplicare si intrucat numarul genelor timpurii este destul de redus, exista sanse apreciabile ca proteina care declanseaza sinteza de ADN sa fie insusi antigenul nuclear indus de virusul Polioma (respectiv SV40).
Asadar, in stadiul timpuriu al ciclului de viata al virusului oncogen functioneaza numai genele pentru transformarea neoplazica, iar in cursul stadiilor tardive ale infectiei are loc sinteza ADN a particulelor virale fiice si cea a proteinelor structurale ale virusului sub controlul genelor specifice, care insa — potrivit datelor lui Temin mentionate mai inainte — nu au nici o implicatie in cancerogeneza.

Transcrierea ARNm timpuriu al virusului Polioma, cat si aceea a ARNm tardiv se realizeaza de catre un factor specificat de gazda. Modul in care se realizeaza tranzitia de la procesele timpurii la cele tardive ramine deocamdata obscur. Totusi, in problema genezei cancerului ne intereseaza antigenul tumoral (T), nu ..antigenul virotic (proteina virotica structurala) apartinand virionului maturat, deoarece pentru transformarea neoplazica a celulelor si, mai ales, pentru multiplicarea lor ulterioara nu este necesara sinteza panticulelor virale mature, complete. Este limpede ca antigenul tumoral (T) este o proteina primitiva, sintetizata cu metabolismul anaerob intranuclear sub controlul unei gene timpurii care — precum am mentionat mai sus — apartine fractiunii virale implicata in transformarea neoplazica. Reamintim aici concluzia conform careia majoritatea virusurilor prezente in tumori, si chiar in celulele tumorale, daca nu sunt intra nucleare sunt virusuri contaminante.

In capitolul destinat ontogenezei anaerobe din prezenta lucrare am inserat dovezi care atesta aparitia succesiva a antigenelor embrionare incepand inca din stadiul foarte timpuriu al ontogenezei. Alti autori, folosind metode imunologiee si histochimice, au constatat de asemenea prezenta de antigene in decursul dezvoltarii incipiente. Sinteza acestor proteine (antigene) primitive are loc exclusiv intranuclear, deci anaerob, controlata de gene ancestrale, deoarece in cursul segmentarii nu este posibila proteosinteza diferentiata citoplasmatica, ci numai cea nucleara.

Este bine dovedita localizarea in nucleul celulelor canceroase a antigenelor T (tumorale) rezultate din transformarea oncogena viral indusa, de exemplu antigenul tumoral al virusului simian 40 (SV40), antigenul nuclear asociat virusului Epstein—Barr (EB). Potrivit unor date experimentale concludente, antigenele nucleare tumorale prezinta interes nu numai pentru valoarea lor potentiala in diagnosticare, ci si ca mijloace pentru izolarea speciilor ARNm specifice prin precipitarea selectiva a polizomilor care contin lanturi de antigene nascinde. Sa ne referim, de pilda, la antigenul T (tumoral) al SV40. Este o proteina intranucleara codata si indusa de virus si nu de celula. El apare dupa initierea, sintezei ARNm timpuriu al SV40 si inainte de atacul replicatiiei ADN si pare a fi implicat in mecanismul reglarii atit al replicarii ADN celular si viral, cat si al expresiei genei virale tardive (sinteza proteinei capsidei, antigenul V). Antigenul T al SV40 este produsul genei A si este legat de, sau aproape de, originea replicatiei genoforului viral (0,67 fractie din lungime, in sensul acelor de ceasornic de la pozitia endonucleazei de restrictie Eco Ri avand greutatea moleculara de 70 000—100 000, greutatea moleculara a antigenului primar (nativ) fiind mult mai mare. Expresia genei A SV40 (pentru antigenul T) in celule transformate creste cu timpul replicatiei ADN viral si isi atinge nivelul cel mai ridicat in nucleele G2, iar in timpal mitozei antigenul T este gasit in citoplasma. In experientele pe nuclee celulare de maimuta infectate cu SV40 si izolate tardiv in infectia litica s-a constatat ca ADN-ul care codifica secventele ARN-ului tardiv este transcris ca un ritm de aproximativ 15 ori mai mare decit cel al ADN-ului care codifica secventele ARN-ului timpuriu. Acest fapt dovedeste ca controlul transcriptional are un rol major in determinarea abundentei relative a claselor de ARN timpuriu si tardiv in celulele infectate litic.

Capatul lui 5' ARNm 19 S timpuriu este complementar cu o regiune sau aproape de, originea replicatiei. Cercetarile localizarii genornice a speciilor de ARN ale virusului simian 40 (SV40) au identificat prin experiente de hibridare in clasa 19 S doua feluri de ARN, unul din aceste tipuri de ARN este complementar cu secventele templatului timpuriu (strand E> minus <0,175 la 0.655> unitati mari) iar celelalte feluri, mai abundente, sunt complementare secventelor in templatul tardiv (strand L plus 0,655 la 0,175 unitati map). De asemenea, au fost detectate doua specii in clasa 16 S a ARNm specific viral tardiv. Unul din tipurile de ARN din aceasta clasa este ARN-ul tardiv major care pare ca specifica proteina majora a capsidei. Potrivit unor date certe, in infectia litica cu SV40, gena A este transcrisa in ARN-ul timpuriu, care este translat in proteina A (antigenul T), aceasta reglandu-si propria ei sinteza prin feed-back negativ care controleaza transcriptia genei A. Potrivit concluziei autorilor citati, acest tip de reglare (autogena) permite unui virus sa aiba un promotor timpuriu foarte eficient si sa retina capacitatea de represie a acestui promotor mai tarziu in infectie, deci sa evite concurenta cu expresia functiilor tarzii. Paza tardiva de multiplicare a virusului simian 40 in celulele permisive de maimuta este caracterizata prin replicarea ADN-ului viral, care depinde atit de controlul exercitat de celula gazda, precum am mentionat mai sus, de prezentii proteinei virale functionale timpurii. Replicarea ADN-ului viral SV40 implica formarea intermediarului replicativ, iar odata inceputa replicarea, este initiata si transcriptia genelor virale tardive rezultand ARNm pentru proteinele capsidei virusului. In cazul blocarii replicatiei ADN-ului viral SV40, implicit este suprimata sinteza ARNm tardiv; deci transcriptia templatilor in acest ARNm necesar exprimarii proteinelor capsidei apare ca o consecinta a replicarii ADN-ului viral. Cu alte cuvinte, in transcrierea genelor tardive sunt implicate insesi moleculele ADN virale replicatoare sau o clasa speciala a moleculelor replicatoare. Expresia genei timpurii a SV40 este insa strict necesara pentru stabilirea si mentinerea unei stari transformate. Studiul experimenital al transformarii culturilor primare de celule ale rinichiului puiului de sobolan prin fragmente din molecula de ADN a virusului simian 40 (SV40), deci mai mici decit lungimea genoforului, a demonstrat ca fragmentele ADN cu activitate transformanta au continut intreaga regiune timpurie a ADN-ului SV40. Daca insa Endo R. Hpal a introdus o ruptura in regiunea timpurie, aceasta a inactivat capacitatea transformanta observata, dovada ca nici o transformare nu a fost constatata la vreunul din cele 3 fragmente testate.

Studiul reglarii expresiei transcriptiei virale si al expresiei antigenului tumoral (antigenul T) in celulele de soarece 3T3 transformate prin virus simian 40 (SV40) a demonstrat ca in cazul opririi ciclului celular in perioada G1, majoritatea celulelor devin antigen T negative. Inductia proliferarii in cultura determina reaparitia antigenului T in cele mai multe celule, concomitent cu inducerea sintezei ADN. Ratiunea disparitiei antigenului T in celulele oprite in G1 pare sa rezide intr-un control transcriptional care opereaza asupra ADN-ului viral integrat, dovada ca aceste celule contin o neinsemnata cantitate de ARN specific al SV40. In concluzie, transcriptia genoforului viral SV40 in celulele transformate este dependenta de ciclul celular. Foarte probabil, transformarea prin virus Polioma interfereaza de asemenea si cu diferite conditii care pricinuiesc oprirea ciclului celular in G1. De asemenea si prin cercetarea expresiei antigenului tumoral in linia celulara T2 de neurosarcom uman s-a constatat o crestere progresiva a expresiei antigenice inceputa in mitoza tardiva si G1 timpurie cu maximum de expresie in G1 medie. Apoi, expresia antigenica decima la nivele minime in S si faza G2. Este important sa mentionam si dovada ca alfafetoproteina (AFP) este sintetizata de la faza G1 tarzie pana la sfirsitul fazei S, timp de 9 ore, in clona C4 a hepatomului AH66 si 25 de ore in clona A1 din acelasi hepatom. Productia de albumina s-a realizat de la faza S tarzie la inceputul fazei G2 timp de 4 ore in C4 si 9 ore in A1, fapt care a reprezentat aproximativ 1/2 sau 1/3 din timp.