virusul oncogen

Mai intii trebuie sa mentionam ca depistarea genelor implicate in transformarea maligna intimpina o serie de dificultati. Bunaoara, s-a dovedit ca doua virusuri pot fi prezente in acelasi timp in aceeasi celula, determinind afectiuni diferite. Genoforul fiecaruia este codificat diferit si nu exista un paralelism intre acidul nucleic viral si afinitatea lui biologica (Wyatt, 1952). Mai mult decit atat, tumorile maligne ca si tesuturile cu crestere rapida pot sa gazduiasca cu usurinta, in mod secundar, cele mai diferite tipuri virotice (A. Graffi si H. Bielka. 1962). insa de nenumarate ori structurile corpusculare virotice puse in evidenta cu ajutorul microscopiei electronice in diverse tumori canceroase umane si animale s-au dovedit a fi pina la urma neoncogene. .Asocierea virusurilor in acelasi organism infectat face ca pe langa antigenele apartinind virusului oncogen sa apara si antigene supraadaugate apartinind unor diverse virusuri intamplatoare. S-a demonstrat ca ,,O serie de microorganisme patogene (micoplasme, bacterii, paraziti) sunt prezente in tumori si sunt incriminate a avea un rol direct sau ajutator in cancerizare (de exemplu, imunosupresor specific sau nespecific) (O. Costachel, 1973). Autorul citat subliniaza si faptul important ca majoritatea virusurilor prezente in tumori, si chiar in celulele  tumorale, daca nu sint intranucleare, sint virusuri contaminante, prezente intimpiator la gazda, sau virusuri ajutatoare (helperi), care actioneaza, probabil, mai mult asupra gazdei sau a proprietatilor generale (de exemplu, mitoza)ale celulelor ei (9)  (O.Costachel, 1973).

Identificarea virusului oncogen pe baza prezentei sale strict intranucleare constituie un argument valoros in sustinerea tezei noastre conform careia genele virale cancerigene apartin tipului anaerob de acid nucleic. Afirmam acestea, deoarece, potrivit datelor actuale din literatura de specialitare, oricare virus oncogen cunoscut poseda doua feluri de gene strict deosebite in privinta continutului informational, al functiei si, bineinteles, al antigenelor ce le determina. Asadar, genoforul viral oncogen exprima un mozaic antigenic, fapt care implica dificultati si confuzii in partajarea proteinelor determinate de segmentul genic cancerigen si de segmentul genic care codifica proteinele structurale ale virionului.

Recent, prof. dr. John H. Subak Sharpe, directorul Institutului de virusologie din Glasgow sublinia ca acidul nucleic al adenovirusului Polioma (ca si virusul SV40) este similar cu cel al lui Phi X 174, probabil cel mai mic virus cunoscut, si contine numai circa 7—8 gene. Cu toata structura lui genetica atit de simpla poate determina tumoarea maligna. Cantitatea de informatie necesara provocarii cancerului apare de-a dreptul infinitezimala fata de stocul informational al genomului nuclear uman. Intr-o conferinta intitulata Iradierea virusurilor oncogene si disociatia functiilor virale, tinuta recent la Bucuresti, la invitatia Institutului oncologic, dr. R. Latarjet, directorul Fundatiei ,Curie din Paris, a aratat ca virusul Polioma supus actiunii radiatiilor ultraviolete si roentgen isi disociaza doua functii virale distincte: infectioasa si cancerigena. Prima este relativ sensibila la doze mici de radiatii X, insa functia cancerigena (disociabila si evidentiabila prin metode tehnice noi) este radiorezistenta. Caracteristici similare au fost dovedite si la alte virusuri oncogene (Rous, Friend). J. D. Watson (laureat Nobel in anul 1962), in cartea sa Biologia moleculara a genei (1974). subliniaza ca in celulele transformate se manifesta functional numai o parte din genomul virusurilor Polioma sau SV40. In 1974, Howard Temin (laureat Nobel in anul 1975), pe baza unui bogat material experimental, afirma ca Genomul RSV (virusul sarcomului Rous — n.n.) consta din doua parti: o parte contine genele specifice proteinelor virionulul si, deci ale structurii virioniulul; cealalta parte contine genele pentru transformarea neoplazica .....Aceste gene sint RNA (acid ribonueleic — n.n.) in virion RSV. Cand RSV provoaca cancer, aceste gene sint transmise in DNA si se integreaza cu DNA (acid dezoxiribonucleic ) celular formind noi gene DNA pentru transformarea neoplazica . . . Extrem de concludenta este izolarea din celulele infectate cu RSV a DNA infectios continind informatia pentru producerea RSV si transformarea neoplazica.Potrivit unei stiri aparuta in presa in octombrie 1975. un grup de experti ai Universitatii din California ar fi reusit sa izoleze dintr-um virus o gena implicata in transformarea celulelor sanatoase in formatiuni maligne.

Cancerul la plante este provocat de ADN-ul provenit de la Agrobacterium tumefaciens (Manigault si colab., 1956). Yago si Hagemen (1972), experimentind pe radacina de morcov, au demonstrat ca procesul de cancerizare este precedat de un transfer de ADN bacterian in celule vegetale. Un fragment din aceasta secventa nucleica se integreaza in peisajul biochimic al celulei vegetale transformind-o in celula canceroasa cu morfologie distincta. Potrivit datelor publicate de M. Stroun si colab. (1967), tumoarea plantei elaboreaza un ADN cu densitate intermediara intre ADN bacterian si cel al plantei gazda, deci cu un continut informational diminuat in comparatie cu ADN-ul nuclear al plantei parazitate.

Asadar, numai o fractiune din genoforul virusului oncogen este implicata in transformarea maligna si, fapt deosebit de important, acest rol nefast nu revine genelor specifice proteinelor virionului si, deci, ale structurii virionului, ci unei gene sau maximum doua. care, potrivit unor date certe, de netagaduit, pe care le mentionam in cele ce urmeaza — sint anaerobe (ancestrale) si codeaza antigenul tumoral (T), nu antigenul viral (V). Astfel, in cursul transformarii neoplazice sub actiunea virusului celulele sufera o simplificare a exigentelor legate de proliferare si cresc mai usor in culturi in comparatie cu celulele normale corespunzatoare (Lederberg, 1946; Beaudreau si colab., 1960; Braun, 1960). Daca nu fiecare virus infectios, cel putin fiecare familie de virus prezinta la microscopul electronic aspecte de un tip particular, provenite din conflictul celula-virus, rezultind incluziuni de cele mai diverse tipuri. La virusurile tumorale insa se constata o uniformitate morfologica. Dealtfel, dificultati considerabile in conceptia formarii endogene a virusurilor oncogene constau in uniformitatea morfologica a acestora, evidentiata in ultimii ani prin cercetarile facute !a microscopul electronic (Graffi si Bielka, 1962) (33, p. 406). Virusurile infectioase, in general, au un tropism celular specific, insa, potrivit datelor actuale, virusul oncogen poate invinge bariera dintre specii si dintre tesuturi, realizindu-se transmiterea virala eteroloaga.

Se stie ca virusurile nu poseda enzimele glicolizei si ale respiratiei pentru extragerea energiei (genoforul viral nu contine informatia pentru sinteza sistemelor energetice proprii) si nici enzimele pentru efectuarea sintezelor. Oncornavirusurile contin insa enzima polimeraza ADN dependenta de ARN (reverstranscriptaza). Virusurile nu poseda un metabolism autonom, sint inerte metabolic. In celula pe care o invadeaza ocupa o pozitie de comanda, utilizind sistemul energetic si materialele necesare sintezelor furnizate de catre aceasta.
Referindu-ne la virusul oncogen, putem spune ca datorita celulei gazda se realizeaza dublul mesaj genetic viral: oncogen si specific proteinelor virionului, adica executarea programelor continute in cele doua parti distincte care alcatuiesc genoforul viral (sinteza proteinelor virale precoce si tardive, replicarea secventei nucleice virale, asamblarea acestora si reconstituirea particulei virale complete si identica matritelor sale). Astfel, virusul oncogen, ca oricare virus dealtfel, este multiplicat de catre celula gazda. Este deosebit de important sa subliniem ca sinteza unui mare numar de virusuri infectioase cunoscute necesita neaparat si energie de respiratie, pe cind multiplicarea oncogenelor solicita numai energia glicolizei anaerobe, fapt demonstrat de catre Artrice Valentine Bader (1972), si anume reproducerea virusului ARN tumoral in celule cu mitocondrii deteriorate experimental.

Astfel, in prezenta virusului infectios exogen respiratia celulei nu se modifica. insa in cazul inhibarii experimentale a respiratiei sau a sistemelor producatoare de energie nu are loc multiplicarea virusului litic. De pilda, fluoroacetatul (inhibitor al ciclului Krebs) inhiba sau ter- giverseaza dezvoltarea in celulele nervoase a virusului poliomielitic (tulpina Lansing) daca este administrat la o ora dupa inocularea intracerebrala a virusului (Ainslie, 1952) si scade net procentul de maimute paralizate daca se injecteaza in primele trei zile dupa inocularea acestora cu virusul poliomielitic tip 1 (Francis si colab., 1954). Virusul Folio si virusul encefalitei de primavara-vara sint multiplicate si de celule canceroase mai diferentiate, deci care au si un procent mai crescut de energie de respiratie. Cind insa cu ajutorul 2,6-DAP se blocheaza respiratia celulelor canceroase, implicit este inhibata si multiplicarea virusului Polio (Gifford, Robertson si Syverton, 1954), desi, precum, se stie, chiar si celulele canceroase mai diferentiate dispun de o glicoliza destul de intensa. Dinitrofenolul, decuplant al fosforilarii oxidative (Sapot, 1955), inhiba multiplicarea virusului vaccinal si virusului gripal cultivati in vitro.
La plante, de exemplu la alge, este dovedita cresterea vertiginoasa a ratei respiratiei paralel cu marimea titrului de particule virale (St. Peterfi si Al. Ionescu,1976) (65, p. 384). Exista o erioada de timp limitata in care se observa proportionalitatea directa intre cresterea virusului mozaicului tutunului si intensitatea respiratiei in tesutul vegetal (L. Murozobova, 1962).
Dupa cum se mentioneaza intr-un interesant articol intitulat Orientari contemporane in genetica, publicat in iulie 1964 in Contemporanul John Bernal considera ca in celula vie infestata cu virus se nasc astfel, pe o cale parazitara, vechi rudimente ale vietii, asa cum au aparut ele acum milioane de ani, cind primele structuri organice se sintetizau la suprafata cristalului de cuart (St. Milcu, N. Giosan, si P. Raicu). Astfel se explica de ce sub actiunea invaziei virotice experimentale are loc o intensificare constanta a glicolizei (Lwoff si Lwoff, 1960; Fisher si Fisher, 1961; Frunder, 1968). In cazul fragmentului genic viral oncogen. cerintele lui se rezuma numai la glicoliza anaeroba. De exemplu, dupa inocularea virusului sarcomului Rous in musculatura aripilor la gaini se constata o puternica glicoliza anaeroba. Singele recoltat din vasele aferente contine un procent mai crescut de acid lactic si un continut mai scazut de glucoza decit singele vaselor aferente (G. Cori si F. Cori, 1925). O constatare similara seface si la culturile celulare embrionare de pui transformate prin virusul Rous (Steck si colab., 1968). La puii de gaina inoculati cu virusul eritroblastozei creste acidul lactic in ser,  precum si glicoliza aeroba in ficat, rinichi si splina (Saigo si Kertai, 1964). La copii cu eritroblastoza s-au gasit valori mai mari ale lacticdehidrogenazei (LDH) si mai ales ale aldolazei plasmei (Sitzman, 1963)
Potrivit datelor prezentate de Reeley si colab. (S.U.A.), Joffe (Israel) si Rouson (Anglia) la al VlII-lea Congres mondial de oncologie —Moscova (1962), s-a constatat ca dupa inocularea la soarece a virusului Reeley (virus izolat din cele mai variate tumori la soareci, transplantabile timp indelungat) paralel cu o considerabila viremie (pina la 1014) are loc o augmentare a fermentilor plasmei in decurs de 24 de ore, in special a LDH (aceasta creste de 10 ori), precum si cresterea pronuntata a glicolizei anaerobe in tumorile provocate cu acest virus.

Sunt valoroase si dovezile obtinute cu ajutorul rezonantei electronice paramagnetice, metoda cu care s-a constatat aparitia radicalilor liberi in stadiile fermentatiei glicolitice (Commoner, 1958). Este demonstrat rolul important al radicalilor liberi in transformarea maligna si in evolutia tumorilor, punindu-se in evidenta cresterea lor in tumorile cu proliferare rapida, de exemplu in sarcoame (Petiaev, 1972). Potrivit datelor, inhibitori ai reactiei radicalilor liberi (propilgalatul) inhiba specific activitatea fermentilor glicolitici si implicit opresc formarea ca si dezvoltarea tumorilor animale (Neifah, 1962; Vartanean si Emanuel, 1962) si vegetale. Alte experiente au dovedit ca sub actiunea propilgalatului si a altor inhibitori ai radicalilor liberi virusul Rous adsorbit pe eritrocite sau pe stroma isi pierde proprietatile cancerigene. Tesutul sarcomului Rous incubat cu propilgalat isi pierde proprietatea de transplantare. Aceste efecte sint datorate interactiunii dintre inhibitori (propilgalat) si virusul Rous, nu intre propilgalat si substratul virusului (eritrocite, stroma, tesut sarcomatos). Daca incubarea nu este prelungita procesul este reversibil. Astfel, prin spalarea (indepartarea cu ser fiziologic) a propilgalatului virusul isi recapata proprietatile tumorale, iar tesutul sarcomatos, proprietatea de transplantare (Elhovskaia si colab., 1962). Recent, s-a demonstrat experimental ca atit celulele cu mitocondriile intacte, cit si celulele cu mitocondriile degenerate experimental sub actiunea colorantului EB (Etidium-bromid) reproduc particule virale oncogene cu morfologie intacta (virusul sarcomului Rous, virusul leucemiei Rauscher). Sinteza componentilor virusului oncogen are loc si in celulele cu mitocondriile alterate, deci — conchide autoarea — integritatea mitocondriei nu este esentiala pentru reproducerea virusului ARN tumoral (Artrice Valentine Bader, 1972). Alte cercetari experimentale au demonstrat ca odata patruns in celule, virusul Rous tinteste mitocondriile (Kara si colab., 1971; Richert si Hare, 1972), fapt care provoaca lezarea acestor organite si favorizeaza cresterea compensatorie a glicolizei.
Odata integrata in genomul celulei gazda, fractiunea virala oncogena se afla in stricta dependenta de metabolismul anaerob intranuclear. Relatia stricta a virusului tumoral cu metabolismul anaerob al celulei parazitate o atesta si faptul ca aceasta structura bioida este foarte sensibila la actiunea oxigenului, inactivindu-se daca filtratul este barbotat in aer atmosferic (Lohman si Schmidt, 1956). Rezultate experimentale concludente in aceasta privinta s-au obtinut cu virusul Rous (Mueller, 1928), virusul eritroblastozei (Engelbreth-Holm si Frederiksen, 1938), agentul leucemogen al soarecelui (Lohman si Schmidt, 1956). Pentru a preintimpina inactivarea virusului, filtrarea se face in conditii anaerobe. Substantele reducatoare (cisteina, glutationul) reactiveaza virusul anterior inactivat de catre oxigen si il protejeaza impotriva oxidarii grupelor SH de catre oxigenul atmosferic.
Fiind cunoscut rolul hipoxiei in radioprotectie, ca si faptul ca acizii nucleici ancestrali erau perfect adaptati la radiatiile ionizante, devine explicabila rezistenta virusurilor oncogene la radiatiile Roentgen; aceasta s-a constatat la virusul papilomului Shope (Syverton si colab., 1941), virusul sarcomului Rous, acesta din urma fiind inactivat numai la o doza de 6 milioane r (Lacassagne si Nyka, 1958), virusul limfomatozei (Burmeister, 1952), virusul eritroblastozei (Jarmai si colab., 1932), si la virusul leucemiei limfatice a soarecelui (Rudali, 1958).
St. S. Nicolau (1955), in interesanta si valoroasa monografie intitulata Cancer si virusuri, arata ca a constatat in diverse viroze pseudo-celule gigante . . . rezultate din multiplicarea amitotica a elementelor celulare invadate de germeni inframicrobieni. . . Fenomenul de proliferare celulara activa amitotica sub influenta germenilor inframicrobieni nu pare a avea loc in scop reparator, in sinul unui tesut in care distractiile rezultate din conflictul macroorganism si inframicroorganism ar obliga la o regenerare intensa prin insasi multiplicarea tesutului gazda fata de virus.
Fenomenul fiind mai general, intâlnit in prezent in mai multe viroze si sub felurite aspecte, dezvaluie — credem — proprietati speciale ale germenilor inframicrobieni.   
Astfel, St. S. Nicolau, in lucrarea citata, tine sa sublinieze ca in unele din aceste boli celulele sensibile la actiunea patogena a inframicrobilor, in proliferarea lor intensa, realizeaza chiar un inceput de organizare tumorala.   
Stabilirea unei relatii intre multiplicarea virala, amitoza si transformarea maligna prezinta o mare importanta fiindca, precum se cunoaste, amitoza este tipul diviziunii celulare anaerobe, deci genele virale care sint multiplicate si se exprima in aceste conditii fac parte din categoria acizilor dezoxiribonucleici anaerobi (ancestrali). Mentionam ca nu exista diferente citologice de baza intre celulele tumorale si elementele celulare din procesele re generative. Astfel, In cazul regenerarii si al proliferarilor neoplazice, amitoza devine frecventa in tesuturile in care mitoza este de regula (C. Tasca, 1976).
S-a demonstrat experimental ca fragmentul genic viral oncogen se integreaza printr-un crossing-over in genomul celulei gazda sub forma de provirus, foarte precoce, in citeva ore. Exista motive — spune J. D. Watson — sa se presupuna ca atit in cazul virusului Polioma, cit si in cel al virusului SV40 se integreaza si persista in celula transformata intregul genom viral, nu numai un segment al acestuia, insa, precum s-a dovedit, numai un segment din genoforul virusului oncogen este implicat in malignizarea celulei.
Cancerul virotic experimental (de pilda, sarcomul Rous, leucemia) poate aparea dupa citeva zile de la inocularea materialului virotic oncogen, incit avem impresia ca cel de-al doilea stadiu (cel al tumorii benigne) este sarit (A. Graffi si H. Bielka, 1962) (33).
Oblgind celula gazda sa recurga cu strictete la metabolismul anaerob pentru realizarea mesajului genetic viral, fractiunea genica oncogena isi tradeaza fara echivoc provenienta filogenetica ancestrala (anaeroba). Provirusul (materialul genetic viral integrat) reliefeaza importanta deosebita, a procesului hibridizarii, ca fiind un proces foarte specific si care se realizeaza numai daca segmentul unui lant nucleic este complementar cu segmentul celeilalte catene de acid nucleic, adica intre aceste doua portiuni nucleice trebuie sa existe omologie de secventa nucleotidica, ceea ce permite formarea puntilor de hidrogen intre diferitele baze azotate si mentinerea apropiata a celor doua segmente nucleice.
Experiente pe culturi celulare inoculate cu virusuri oncogene cu ADN au aratat ca integrarea (incorporarea) fragmentelor de genom viral in genomul celular are loc in timp scurt, in citeva ore si aceasta insertie se situeaza la o scara care scapa analizei chiar minutioase a cromzomilor metafazici prin metodele actuale ce investigatie (M. Prunieras, C. Delescluse, 1969).
Potrivit unor date recente obtinute experimental in vitro, integrarea genomului viral oncogen in genomul celular s-ar realiza nu numai prin legaturi de hidrogen (adica intre un atom de H legat covalent, avind o sarcina reziduala pozitiva si un atom acceptor (O, N) legat tot covalent si care poseda o sarcina negativa), ci, de pilda in cazul provirusului RSV si al SV40, prin legatura co- valenta (adica prin punerea in comun a unei perechi de electroni intre doi atomi participanti), de natura chimica, orientata spatial si foarte puternica in comparatie cu legatura de hidrogen, asigurind o apropiere foarte strinsa intre cei doi atomi diferiti. Aceste date, desi ar oferi o explicatie a stabilitatii insertiei (virogeniei), nu infirma conditionarea inserarii provirusului de existenta omologiei de secventa nucleotidica a segmentelor nucleice: viral si nuclear comparate si confruntate.
Sa ne referim, de exemplu, la virusul SV40. Expresia genei timpurii a virusului simian 40 este necesara pentru stabilirea si mentinerea unei stari transformate, insa nu se stie precis daca integrarea are sau nu un rol in aceasta expresie. Se admite posibilitatea ca transformarea sa fie urmarea integrarii ADN-ului viral la anumite pozitii sau in anumite orientari in cadrul genomului celular. Totusi integrarea trebuie sa furnizeze un cadru stabil pentru replicatia ADN-ului viral si pentru expresia functiilor sale necesare. Aceasta problema este documentat analizata (in ceea ce priveste intrebarile daca exista specificitate pozitionala limitata fie la pozitiile de recombinare virala, fie ale gazdei, daca genomul viral este in general integrat intact, daca o linie transformata data contine unul sau mai mult de un segment al ADN-ului viral si daca structura ADN-ului viral integrat se schimba in pasaj) intr-un material aparut recent si din care vom cita pasajele care ne intereseaza. Astfel, probabil cel mai simplu model este faptul ca integrarea porneste printr-o singura recombinare reciproca ce rezulta dintr-o insertie liniara a intregului genom viral in genomui gazda (Campbell, 1962). Acest model este corelat cu descoperirea ca intreaga informatie genetica virala este pastrata intr-o anumita forma in multe linii celulare transformate cu SV40, din moment ce ele produc virioni de SV40 de tip salbatic care pot fuziona cu celule permisive (Gerber, 1966; Koprowski, Jensen, Steplewski, 1967: Tournier, Cassingena, Wickert, Coppey, Suarez,1967; Watkins, Dulbecco, 1967). Pe de alta parte, observatii recente indicind ca diferite regiuni ale genomului SV40 sint reprezentate cu diferite frecvente in linia transformata SVT2 sugereaza ca pot fi necesare modele mai complicate, cel putin in unele cazuri (Sambrook, Botchan, Galimore, Ozanne, Petterson, Williams, Sharp, 1974).. . Alternativ, integrarea ar putea aparea prin recombinarea dintre regiunile omoloage ale gazdei si genoamele virale. In acest caz, integrarea ar fi pozitional-specifica numai in masura in care asemenea regiuni ale omologiei ar fi limitate in numar si intindere. In final, integrarea nu poate sa implice nici unul din aceste mecanisme si poate sa apartina clasei de evenimente (cazuri) genetice mai putin intelese incluse sub termenul de recombinare -«nelegitima» (Franklin, 1971). In acest caz nu se poate pretinde ca integrarea ar fi pozitional-specifica. Citeva studii anterioare au sugerat ca in anumite situatii ar putea fi ceva specific integrarii lui SV40. Croce, Koprowski si colab. au obtinut date despre faptul ca informatia SV40 responsabila de transformarea celulelor umane noate fi integrata preferential in cromozomul nr. 7 (Croce, Huebner, Girardi si Koprowski, 1974). Studii recente asupra genoamelor SV40 substituite care au aparut in timpul pasajului de la alta multiplicare au condus la ideea ca recombinarea dintre ADN-urile virale si gazde in timpul infectiei productive a celulelor perrnisive poale aparea preferential in citeva regiuni mici ale genomului viral (Chow, Boyer, Tischer si Goodman, 1974; Lee, Brockman si Nathans, 1975). Pe de alta parte., nu exista  nici o informatie (data) ca recombinarea in timpul infectiei productive apare la pozitii specifice in genomul gazda (Lee, Brockman si Nathans, 1975) . .. Fiecare din liniile SV40 transformant studiate a dat nastere la un numar mic (4 sau mai putine) de fragmente care contin ADN SV40 cind au fost digerate de enzimele Hpa II si Bam HI.    

Simplitatea relativa a modelelor de banda observate indica faptul ca localizarea ADN SV40 nu este facuta la  intimplare prin excizie si prin reintegrarea evenimentelor (cazurilor) in timpul pasajului. Daca ar fi fost asa, ar fi fost de asteptat ca modelele de banda sa fie foarte complexe sau de negasit. La o concluzie similara au ajuns si altii (Botchan si Mc Kenna, 1974).