reactiile antigen-anticorp si detectarea anticorpilor

Proprietatea definitorie a anticorpilor este aceea de a interactiona si de a se combina cu antigenul specific. Aceasta proprietate are ca substrat complementaritatea dintre configuratia spatiala a gruparii com­binative din molecula de anticorp cu gruparea determinanta din mole­cula de antigen. Combinarea antigenului cu anticorpul nu se face prin stabilirea de legaturi covalente intre reactanti, ci prin interactiunea a patru tipuri de forte intermoleculare si anume: forte coulombice. Lega­turi de hidrogen, forte hidrofobe si Van der Waals. Aceste tipuri de forte sunt in relatie inversa cu distanta dintre reactanti (devenind pu­ternice numai cand distanta dintre molecule este foarte mica). Acest lucru este realizat de complementaritatea dintre gruparea combinativa a anticorpului si determinantul antigenic, ceea ce permite ca acesta sa patrunda, ca o cheie intr-un lacat, in gruparea combinativa a anticor­pului. Distanta intermoleculara devenind in felul acesta foarte mica, for­tele de interactiune amintite sunt considerabil crescute.

Combinarea antigenului cu anticorpul este reversibila, complexul disociindu-se cu usurinta, in functie de intensitatea legaturii dintre reac­tanti. Intensitatea legaturii dintre antigen si anticorp este caracterizata prin termenul de afinitate, in cazul sistemelor simple anticorp-haptena, sau prin cel de aviditate, in cazul sistemelor complexe anticorp-antigen. Anticorpii ce se leaga puternic de haptena sau de antigen se numesc anticorpi cu afinitate sau respectiv aviditate mare si invers. Determinari de afinitate au evidentiat faptul ca chiar anticorpii dintr-o singura clasa, dirijati contra unui determinant antigenic unic, au grade diferite de afi­nitate (73) (89).

Pe interactiunea primara dintre antigen si anticorp, respectiv pe demonstrarea directa a legarii antigenului de anticorpii specifici aflati in serul de investigat, se bazeaza o prima categorie de teste de eviden­tiere si masurare a anticorpilor. In functie de natura antigenului si de prezenta altor elemente in mediul de reactie, unirea antigenului cu anti­corpul provoaca diverse fenomene sau reactii secundare (precipitare, aglutinare, activarea C cu hemoliza consecutiva) ce stau la baza unei a doua categorii de teste de decelare si evaluare cantitativa a anticorpilor. In sfarsit, fenomenele produse in vitro sau in vivo in urma desfasurarii unei reactii antigen-anticorp in tesuturi sensibilizate pot fi si ele utilizate ca teste de detectare si de evaluare semicantitativa a anticorpilor. In cele ce urmeaza vom trece in revista principiile pe care se bazeaza di­versele tehnici de detectare si masurare a anticorpilor, subliniind indeosebi limitele si semnificatia, din punctul de vedere al alergologului, a rezul­tatelor obtinute (expunerea in detaliu a acestor tehnici ocupa sute de pagini in tratate de specialitate, printre care citam cartea clasica a lui Kabat si Mayer (54) si tratatul editat de Weir (108).

Testele bazate pe interactiunea primara dintre antigen si anticorp masoara cantitatea de anticorpi fie prin determinarea capacitatii serului investigat de a lega antigenul, fie prin masurarea cantitatii de imunoglo­bulina legata de antigenul cuplat de un suport insolubil. Ele folosesc o metoda sensibila, de obicei marcarea izotopica sau fluorescenta, pentru masurarea antigenului sau respectiv a anticorpului combinat, dupa sepa­rarea, prin diverse procedee, a reactantului ramas necombinat. Tehnici din aceasta categorie sunt folosite in studii speciale de imunochimie, pentru determinarea afinitatii anticorpilor, utilizand antigene marcate si separand complexele antigen-anticorp de antigenul liber prin precipitare cu sulfat de amoniu (procedeu aplicabil numai in cazul antigenelor solu­bile la concentratia utilizata) sau cu un ser antiglobulinic. Folosind seruri specifice pentru diverse clase de imunoglobuline, se poate determina distributia anticorpilor in diverse clase.

Prin procedeul de imunoadsorbtie cantitativa se pot separa si ma­sura anticorpii serici de o anumita specificitate. In acest scop, anticorpii dintr-un volum de ser sunt adsorbiti pe particule insolubile pe care s-a cuplat, prin diverse procedee, antigenul specific. Dupa spalarea particu­lelor pentru indepartarea contaminantilor, anticorpii sunt liberati din complexe prin scaderea pH-ului. Particulele insolubile ce contin antige­nul sunt separate prin centrifugare, in supernatant ramanand in exclusi­vitate anticorpii cu specificitatea respectiva, ce pot apartine insa la diverse clase de imunoglobuline. intr-ovarianta a acestui test, anticorpii combinati cu antigenul cuplat pe particule insolubile sunt pusi sa reac­tioneze cu anti-imunoglobulina marcata, masurandu-se radioactivitatea retinuta de complexele antigen-anticorp. Folosind seruri anti-Ig specifice de clasa, se poate determina distributia anticorpilor in diversele clase de imunoglobuline. Astfel, in testul de radioalergoadsorbtie (RAST) alerge­nul este legat covalent de un disc de hartie, care este tratat cu serul de analizat si apoi cu un ser anti-IgE marcat radioactiv, masurandu-se, dupa spalare, radioactivitatea ramasa pe hartie (110). Asadar, in acest test se dozeaza exclusiv anticorpii IgE specifici fata de alergenul dat, constituind cel mai specific si cel mai sensibil test pentru dozarea acestei clase de anticorpi.

Tot din aceasta categorie de teste face parte si testul de radioimunodozare, folosit, intre altele, pentru dozari hormonale. El se bazeaza pe faptul ca legarea antigenului marcat radioactiv de o cantitate fixa de an­ticorpi este inhibata de adaugarea antigenului nemarcat. Inhibitia pro­dusa de antigenul nemarcat continut in esantionul de dozat este compa­rata cu cea produsa de doze etalon de antigen pur. Acelasi principiu sta la baza testului de radioimunoadsorbtie (RIST), utilizat pentru dozarea IgE. Pentru efectuarea lui, o cantitate determinata de anticorpi specifici anti-IgE, legati de un polimer, este amestecata cu o cantitate determi­nata de IgE marcata si cu o anumita cantitate din serul de analizat. Dupa gradul de inhibitie produsa de esantionul de ser investigat asupra legarii IgE marcate, de catre anticorpii anti-IgE insolubilizati, se calculeaza concentratia de IgE din serul analizat (89) (108). Acest test dozeaza deci cantitatea totala de IgE din ser, care — dupa cercetarile mai multor autori (6) (52) (99) — este cu mult mai mare in serul indivizilor atopiei decat la normali.

A doua categorie de teste utilizeaza diferite efecte produse de reac­tia anticorpului cu antigenul specific. Cu unele exceptii, ele nu masoara in mod direct cantitatea de anticorpi, ci amploarea unuia sau altuia din efectele lor secundare. Trei teste clasice (in numeroase variante) fac parte din aceasta categorie: precipitarea, aglutinarea si fixarea C.

Cand antigenul este constituit din macromolecule solubile, adaugarea lui in proportii adecvate in serul ce contine anticorpi este urmata de formarea de precipitat. Precipitarea este consecinta formarii unor com­plexe antigen-anticorp ce alcatuiesc retele tridimensionale. Anticorpii fiind bivalenti, pentru formarea unor astfel de retele este necesar ca molecula de antigen sa aiba cel putin trei grupari determinante, condi­tie indeplinita practic, de toate antigenele naturale. Cercetari clasice au aratat ca la proportia optima (sau echivalenta) a celor doi reactanti, intreaga cantitate de anticorpi se gaseste in precipitat si ca in prezenta excesului de antigen se formeaza complexe antigen-anticorp solubile. Reactia de precipitare poate fi efectuata in diverse moduri:

-examinarea macroscopica a depozitului de precipitat format pe fundul eprubetei;

-prezenta inelului de precipitare format la suprafata de separare dintre dilutia de antiser si cea de antigen;

-determinarea cantitatii de proteina din precipitatul format la echivalenta;

-formarea de benzi de precipitare dupa difuziunea celor doi reac­tanti prin gel de agar (Tehnica Ouchterlony);

-migrarea electroforetica asociata cu imunoprecipitarea (imunoelec- troforeza);

-determinarea radioactivitatii precipitatului format cu un antigen marcat cu un izotop radioactiv.

Dupa cum s-a mai aratat, toti anticorpii poseda proprietatea de a precipita cu antigenul specific, bineinteles respectind conditiile de efec­tuare a reactiei de care am discutat.

Cand antigenul este corpuscular (bacterii) sau celular (hematii, leuco- cite), reactia antigen-anticorp se manifesta sub forma de aglutinare. Daca un antigen solubil sau o haptena sunt legate de hematii (si exista mai multe procedee pentru a realiza acest lucru) sau de alte particule folosite ca suport, serul ce contine anticorpi specifici fata de antigenul sau haptena respectiva aglutineaza hematiile astfel sensibilizate. Aceasta reac­tie poarta numele de hemaglutinare pasiva si constituie unul din cele mai sensibile teste de detectare a anticorpilor. El este foarte util pentru detectarea anticorpilor fata de haptene de origine medicamentoasa, cum sunt penicilina si aspirina (20) (21). Adaugat in cantitate potrivita in dilutiile de ser specific, antigenul (sau haptena) inhiba aglutinarea hema­tiilor invelite cu antigenul respectiv. Fenomenul acesta, denumit inhi­bitia hemaglutinarii pasive, se datoreste saturarii gruparilor combinative ale anticorpilor de catre antigenul specific si sta la baza testului cu ace­lasi nume, utilizat pentru confirmarea specificitatii reactiei respective. Adaugarea haptenei in cantitati adecvate in serul specific inhiba, dealtfel, si celelalte reactii antigen-anticorp, cum sunt precipitarea sau fixarea complementului.

Cand serul specific este proaspat, avand deci continutul intact de C, iar antigenul este celular (hematii, limfocite, bacterii), se produce liza elementelor respective, asa-numita citoliza imuna, un caz particular constituindu-1 hemoliza imuna. In cazul cand hematiile invelite cu un antigen sau o haptena, prin diverse procedee, sunt suspendate in dilutii de antiser proaspat sau in care s-a adaugat alexina, se produce de asemenea liza eritrocitara, fenomen denumit hemoliza imuna pasiva, ce sta la baza testului cu acelasi nume.

Activitatea litica a serurilor specifice vechi sau in care C a fost in­activat prin caldura (incubare 30 de minute la 56°—58°C) este restabilita prin adaugarea de ser proaspat (de obicei ser de cobai) sau de preparate speciale de alexina. In urma desfasurarii unei reactii antigen-anticorp in prezenta C, acesta este consumat in parte sau in totalitate, in functie de cantitatea reactantilor. Fenomenul poarta denumirea de fixare a comple­mentului si sta la baza testului cu acelasi nume, utilizat pentru detec­tarea si masurarea unei reactii antigen-anticorp in cazul cand anticorpii implicati sunt capabili sa fixeze C, asa cum este cazul cu cei din clasa IgM si cu unele subclase de IgG.

Cea de-a treia categorie de teste foloseste pentru detectarea si eva­luarea cantitatii, sau mai corect a activitatii anticorpilor, anumite modi­ficari produse in organism sau in tesuturi in vitro, ca urmare a desfasu­rarii unei reactii antigen-anticorp la nivelul lor. Liberarea de histamina, degranularea mastocitelor si bazofilelor, modificari vasomotorii si de per­meabilitate, contractia musculaturii netede viscerale constituie unele din modificarile tisulare ce stau la baza testelor din aceasta categorie. Desi exista, in mare, o corelatie intre intensitatea sensibilizarii organismului sau a tesuturilor (deci a cantitatii de anticorpi ce participa la reactie) si intensitatea modificarilor produse dupa interactiunea cu antigenul speci­fic, variabilitatea testelor bazate pe aceste reactii este cu mult mai mare decat in cazul testelor din prima si cea de-a doua categorie. Aceasta va- riabilitate se datoreste la randul ei variabilitatii individuale a diverselor verigi biochimice interpuse intre reactia antigen-anticorp ca veriga ini­tiala si modificarile fiziopatologice inregistrate in testele bazate pe astfel de modificari. Intr-o masura si mai mare decat testele din categoria pre­cedenta, testele din aceasta categorie masoara mai curand capacitatea an­ticorpilor de a produce o anumita reactie alergica, decat cantitatea lor. Deoarece numai anumite clase sau subclase de anticorpi sunt capabile sa produca reactii de hipersensibilitate, testele acestea sunt de regula mai utile pentru explorarea alergologica decat cele descrise anterior.

Testul de degranulare a bazofilelor (sau testul Shelley) se bazeaza pe faptul ca bazofilele circulante, ca si mastocitele tisulare, provenite de la indivizii cu alergie de tip anafilactic sau atopic, pierd granulatiile ca­racteristice (ce se coloreaza metacromatic cu albastru de toluidina) in urma interactiunii antigenului cu anticorpii fixati pe membrana acestor celule. Practicat in acest fel, testul este denumit direct. In cazul cand ba­zofilele utilizate pentru efectuarea testului provin de la individ normal si sunt sensibilizate pasiv in vitro prin incubare in ser continand reagine, testul se numeste indirect (41).

Determinarea cantitatii de histamina liberata la adaugarea antigenu­lui specific in sangele integral, la suspensii de leucocite sau la fragmen­tele de organe provenite de la indivizi alergici este utilizata in unele ca­zuri ca test de hipersensibilitate. Testul de liberare a histaminei in vitro este practicat mai frecvent sub forma sa indirecta, folosind fragmente de organe (in special de plamani) de la indivizi normali sau de la primate. Liberarea anafilactica de histamina din suspensii celulare sau din frag­mente de tesuturi sensibilizate a fost si este larg utilizata in cercetarile de farmacologie a reactiilor alergice.

Reactia cutanata produsa de injectarea intradermica (intradermo- reactie) a alergenului sau de aplicarea lui pe pielea scarificata (test de scarificare) constituie unul din cele mai simple si totodata cele mai spe­cifice teste pentru diagnosticul hipersensibilitatii. In cazul hipersensibili­tatii de tip anafilactic sau atopic, aceasta reactie se prezinta sub forma eritemato-papuloasa ce apare in cateva minute de la aplicarea alerge­nului specific, atinge intensitatea maxima in 15—20 minute si dispare dupa cateva ore, fara a lasa urme. Reactiile cutanate de tip imediat, pro­duse de testarea directa, se desfasoara identic la indivizii cu hipersen­sibilitate de tip anafilactic, produsa de anticorpi anafilactizanti din unele subclase de IgG, si la cei cu hipersensibilitate de tip atopic, produsa de anticorpi din clasa IgE. Diferentierea acestor doua tipuri de hipersen­sibilitate poate fi facuta prin teste de transfer cutanat, cunoscute sub numele de anafilaxie cutanata pasiva (PCA) si test Prausnitz-Kustner (P-K). Pentru ambele teste, sensibilizarea pielii se face in acelasi mod. O cantitate mica (de obicei 0,1 ml) din serul alergic se injecteaza intra­dermic in mai multe puncte de pe pielea unui individ normal (in ca­zul testului P-K) sau la animale normale din aceeasi specie sau din specii diferite (in cazul testului PCA). Declansarea se face dupa 4—6 ore pentru evidentierea anticorpilor anafilactizanti din clasa IgG sau dupa 48 de ore sau chiar dupa mai multe zile pentru evidentie­rea anticorpilor IgE. In cazul testului PCA, declansarea se face de regula prin injectarea antigenului in circulatia generala, evitindu-se astfel eventuala reactie nespecifica produsa de injectarea locala a antige­nului. Pentru a aprecia mai usor intensitatea reactiei, odata cu antigenul se injecteaza un colorant adecvat (de obicei albastru Evans), care mar­cheaza prin extravazare locul de producere a reactiei. In cazul testului P-K efectuat pe om, declansarea se face prin administrarea intradermica, in cate unul din punctele sensibilizate, a unei cantitati adecvate din fie­care din alergenii investigati. Intensitatea reactiei se apreciaza dupa diametrul sau suprafata zonei de eritem sau edem. Pe langa diferentele in ceea ce priveste perioada de incubatie in transferul pasiv, anticorpii IgE mai pot fi deosebiti de anticorpii IgG anafilactizanti prin faptul ca primii pierd capacitatea de a transfera sensibilitatea dupa incubarea se­rului cateva ore la 58° sau prin tratare cu 2-mercaptoetanol.

Despre unele teste de detectare a anticorpilor din celulele anticorpoformatoare sau de pe membrana unor celule capabile sa-i fixeze in mod secundar vom aminti in cele ce urmeaza.