antigen tumoral

Cea mai importanta observatie aratata aici este faptul ca modelul fragmentelor de restrictie care contin secvente SV40 este diferit pentru fiecare din seriile de linii de celule transformate cu SV40 derivate independent din aceeasi linie parentala (BALB/c 3T3). Acest lucru arata ca structura ADN-ului SV40 integrat si/sau localizarea lui in genomul gazda trebuie sa fie diferita in variatele linii transformate. Acest fapt sugereaza la rindul sau ca integrarea nu este absolut pozitional-specifica. Nu putem exclude posibilitatea ca exista specificitate cu privire  la pozitia de recombinare fie pe genomul viral sau pe genomul gazda, dar datele par sa excluda specificitatea cu privire 1a ambele pozitii simultan. Aceasta interpretare se bazeaza pe presupunerea, inca netestata, ca rearanjamentele ADN-ului viral (insertii, deletii etc.) nu apar obisnuit nici inainte, nici datorita evenimentului integrarii primare. Ar trebui notat ca datele nu exclud posibilitatea ca integrarea apare la secvente nucleotidice specifice daca mai multe din aceste secvente sunt localizate in diferite pozitii pe genoamele gazda sau virale (Gury Ketner si Thomas J. Kelly Jr.,1976).

Are perfecta dreptate J. D. Watson (1974) cand afirma ca ramine inca deschisa problema avantajului pe care il dobindeste un virus tumoral in urma inserarii lui in cromozomul celulei gazda sub forma de provirus. Pare greu de presupus ca inserarea ar fi expresia unui joc al hazardului, intrucit ea este conditionata de existenta unor omologii de secventa nucleotidica intre anumite regiuni ale cromozomului celular si ale celui viral. Incapacitatea noastra de a gasi deocamdata un raspuns la aceasta enigma trebuie judecata insa in corelatie cu faptul ca sintem tot atit de putin edificati si in privinta lizogeniei bacteriene. Nici pe acest tarim nu sintem inca in stare sa deslusim vreun avantaj selectiv al starii de profag. Prin metoda de hibridare a acizilor nucleici s-a constatat ca ADN extras din virusul Polioma hibrideaza nu numai cu ADN din tumoarea Polioma, ci si cu ADN extras din soarecele normal (Axelrod, Hobel si Bolton,1964). Mai mult inca, S-a constatat ca si ADN normal extras de la mai multe specii de animale contine secvente comune cu ADN din Polioma, sugerind ca complementaritatea» inseamna secvente polinucleotidice comune cu organismele superioare (Maria Furnica, 1972). Omologia de secventa dintre ADN viral oncogen, ADN din tumoarea indusa de respectivul ADN si o portiune (o regiune scurta) din ADN normal din diverse specii animale, demonstrata cu tehnica hibridarii acizilor nucleici, atesta fara echivoc originea filogenetica anaeroba (ancestrala) a acestor fractiuni nucleice.
Fiind segmente nucleice complementare (omologie de secventa nucleotidica) inseamna ca au un continut informational comun. Aceasta concluzie este perfect valabila si pentru Oncorna (virusul ARN tumoral), deoarece, potrivit dovezilor de laborator aduse de Temin, Baltimore, Dulbecco si Sol Spiegelman (laureati Nobel), informatia acestuia este transmisa in ADN si integrata in genomul nuclear. Transferul de informatie de la ARN la ADN (sintetizarea moleculei de ADN prin reverstranscriere a ARN) se realizeaza cu ajutorul unei enzime specifice (polimeraza ADN dependenta de ARN sau reverstranscriptaza) si, fapt important de semnalat, cercetari interioare au aratat ca acest proces s-ar produce si  in celulele normale, mai ales in stadii embrionare ale animalelor sau in organe in curs de regenerare (N. Botnariuc, 1974) .
In ciclul de viata al virusurilor oncogene se disting, ca si in organizarea genetica a fagilor, doua stadii — unul timpuriu, si celalalt tardiv —, la fiecare din ele avind loc evenimente biochimice proprii stadiului respectiv. De exemplu, la virusul Polioma si SV40 (ambele avind un comportament biologic identic), in stadiul timpuriu se sintetizeaza sub controlul viral câteva proteine al caror rol metabolic exact — cupa cum subliniaza J. D. Wats — nu este inca elucidat. Totusi, s-a demonstrat ca una dintre aceste proteine este intens antigenica (antigenul T) — antigenul specific tumoral — si se acumuleaza in cantitati mari in nucleu. Deoarece atit virusul Polioma, cit si SV40 au proprietatea de a induce sinteza de ADN specific gazdei paralel cu propria multiplicare si intrucit numarul genelor «timpurii» este destul de redus, exista sanse apreciabile ca proteina care declanseaza sinteza de ADN sa fie insusi antigenul nuclear indus de virusul Polioma (respectiv SV40)W (J. D. Watson, 1974) .

Asadar, in stadiul timpuriu al ciclului de viata al virusului oncogen functioneaza numai genele pentru transformarea neoplazica, iar in cursul stadiilor tardive ale infectiei are loc sinteza ADN a particulelor virale fiice si cea a proteinelor structurale ale virusului (J. D. Watson) (106, pag. 504) sub controlul genelor specifice, care insa — potrivit datelor lui Temin mentionate mai inainte — nu au nici o implicatie in cancerogeneza.
Dupa cum considera J. D. Watson, pare mai probabil ca atit transcrierea ARNm timpuriu al virusului Polioma, cit si aceea a ARNm tardiv se realizeaza de catre un factor specificat de gazda. Modul in care se realizeaza tranzitia de la procesele timpurii la cele tardive ramine deocamdata obscur (106, pag. 505). Totusi, in problema genezei cancerului ne intereseaza antigenul tumoral (T), nu ..antigenul virotic (proteina virotica structurala) apartinind virionului maturat, deoarece pentru transformarea neoplazica a celulelor si, mai ales, pentru multiplicarea lor ulterioara nu este necesara sinteza panticulelor virale mature, «complete>> (St. S. Nicolau, 1966). Este limpede ca antigenul tumoral (T) este o proteina primitiva, sintetizata cu metabolismul anaerob intranuclear sub controlul unei gene timpurii care — precum am mentionat mai sus — apartine fractiunii virale implicata in transformarea neoplazica. Reamintim aici concluzia conform careia Majoritatea virusurilor prezente in tumori, si chiar in celulele tumorale, daca nu sint intra nucleare sint virusuri contaminante (O.Costachel, 1973).

In capitolul destinat ontogenezei anaerobe din prezenta lucrare am inserat dovezi care atesta aparitia succesiva a antigenelor embrionare incepind inca din stadiul foarte timpuriu al ontogenezei. Dupa Richardson si colab. (1955), primele antigene apar in stadiul segmentarii. Alti autori, folosind metode imunologiee si histochimice, au constatat de asemenea prezenta de antigene in decursul dezvoltarii incipiente (Brachet, 1940; Ranzi Citterio si Samueli, 1961; Kazuko Inoue, 1961). Sinteza acestor proteine (antigene) primitive are loc exclusiv intranu- clear, deci anaerob, controlata de gene ancestrale, deoarece in cursul segmentarii nu este posibila proteosinteza diferentiata citoplasmatica, ci numai cea nucleara (Ten Cate si colab., 1951; Lovtrup, 1955). Esce bine dovedita localizarea in nucleul celulelor canceroase a antigenelor T (tumorale) rezultate din transformarea oncogena viral indusa, de exemplu antigenul tumoral al virusului simian 40 (SV40) (Todaro si Habel, 1965), antigenul nuclear asociat virusului Epstein—Barr (EB) (Suzuki si Himuna, 1974). Potrivit unor date experimentale concludente, antigenele nucleare tumorale prezinta interes nu numai pentru valoarea lor potentiala in diagnosticare, ci si ca mijloace pentru izolarea speciilor ARNm specifice prin precipitarea selectiva a polizomilor care contin lanturi de antigene nascinde (Schechter, 1973; Schapiro, Taylor si Mc Knight, 1974). Sa ne referim, de pilda, la antigenul T (tumoral) al SV40. Este o proteina intranucleara codata si indusa de virus si nu de celula. El apare dupa initierea, sintezei ARNm timpuriu al SV40 si inainte de atacul replicatiiei ADN si pare a fi implicat in mecanismul reglarii atit al replicarii ADN celular si viral, cit si al expresiei genei virale tardive (sinteza proteinei capsidei, -«antigenul V») (Graessmann A., Graessmann M.. Bobrick si altii, 1976).

Antigenul T al SV40 este produsul genei A (Tegtmeyer, 1972; Carroll, Hager si Dulbecco, 1974; Robb, Tegtmeyer si Ishikava, 1974; Tenen, Baygell si Livingston, 1975) si este legat de, sau aproape de, originea replicatiei genoforului viral (0,67 fractie din lungime, in sensul acelor de ceasornic de la pozitia endonucleazei de restrictie Eco Ri. la dreapta de Eco Ri) (Reed, Ferguson, Davis si Stark, 1975), avind greutatea moleculara de 70 000—100 000  (Del Villano, Defendi, 1973; Tegtmeyer, 1974), greutatea moleculara a antigenului primar (nativ) fiind mult mai mare (Osborn si Weber, 1974; Carroll, Hager si Dulbecco, 1974). Expresia genei A SV40 (pentru antigenul T) in celule transformate creste cu timpul replicatiei ADN viral si isi atinge nivelul cel mai ridicat in nucleele G2, iar in timpal mitozei antigenul T este gasit in citoplasma (Stenman, Zeuthen si Ringertz, 1975). In experientele pe nuclee celulare de maimuta infectate cu SV40 si izolate tardiv in infectia litica s-a constatat ca ADN-ul care codifica secventele ARN-ului tardiv este transcris ca un ritm de aproximativ 15 ori mai mare decit cel al ADN-ului care codifica secventele ARN-ului timpuriu. Acest fapt dovedeste ca controlul transcriptional are un rol major in determinarea abundentei relative a claselor de ARN timpuriu si tardiv in celulele infectate litic (Gilboa si Aviv, 1976).  Capatul lui 5' ARNm 19 S timpuriu este complementar cu o regiune la, sau aproape de, originea replicatiei (Danna si Nathans, 1972; Khoury, Howley, Nathans, Martin, 1975). Cercetarile localizarii genornice a speciilor de ARN ale virusului simian 40 (SV40) au identificat prin experiente de hibridare in clasa 19 S doua feluri de ARN, unul din aceste tipuri de ARN este complementar cu secventele templatului timpuriu (strand «E> minus <0,175 la 0.655> unitati map) iar celelalte feluri, mai abundente, sint complementare secventelor in templatul tardiv (strand «L» plus «0,655 la 0,175» unitati map). De asemenea, au fost detectate doua. specii in clasa 16 S a ARNm specific viral tardiv. Unul din tipurile de ARN din aceasta clasa este ARN-ul tardiv major care pare ca specifica proteina majora a capsidei (Khoury, Carter, Ferdinand si altii, 1970). Potrivit unor date certe, in infectia litica cu SV40, gena A este transcrisa in ARN-ul timpuriu, care este translat in proteina A (antigenul T), aceasta reglindu-si propria ei sinteza prin feed-back negativ care controleaza transcriptia genei A (Reed, Stark, Alwine, 1976). Potrivit concluziei autorilor citati, acest tip de reglare (autogena) permite unui virus sa aiba un promotor timpuriu foarte eficient si sa retina capacitatea de represic a acestui promotor mai tirziu in infectie, deci sa evite concurenta cu expresia functiilor tirzii. Paza tardiva de multiplicare a virusului simian 40 in. celulele permisive de maimuta este caracterizata prin replicarea ADN-ului viral, care depinde atit de controlul exercitat de celula gazda (Pages, Manteuil,. Stehelin, Fiszman, Marx si Girard, 1973), cit si. precum am mentionat mai sus, de prezentii proteinei virale functionale timpurii (Tegtmeyer, 1972). Replicarea ADN-ului viral SV40 implica formarea intermediarului replicativ (Levine, Kang si Billheimer, 1970; Sebring, Kelly, Thoren si Salzman, 1971; Jaenich, Mayer, Levine, 1971: Fareed, McKerlie si Salzman, 1973; Girard, Marty si Manteuil, 1974), iar odata inceputa replicarea, este initiata si transcriptia genelor virale tardive rezultând ARNm pentru proteinele capsidei virusului. In cazul blocarii replicatiei ADN-ului viral SV40, implicit este suprimata sinteza ARNm tardiv (Rapp, Butel, Feldman, Kitahara si Melnick, 1965; Kit, Dubbs, Frearson, Melnick, 1966; Carp, Sauer si Sokol, 1969; Sauer, 1971); deci transcriptia templatilor in acest ARNm necesar exprimarii proteinelor capsidei apare ca o consecinta a replicarii ADN-ului viral. Cu alte cuvinte, in transcrierea genelor tardive sint implicate insesi moleculele ADN virale replicatoare sau o clasa speciala a moleculelor replicatoare (Girard, Marty si Manteuil, 1974). Expresia genei timpurii a SV40 este insa strict necesara pentru stabilirea si mentinerea unei stari transformate. Studiul experimenital al transformarii culturilor primare de celule ale rinichiului puiului de sobolan prin fragmente din molecula de ADN a virusului simian 40 (SV40), deci mai mici decit lungimea genoforului, a demonstrat ca fragmentele ADN cu activitate transformanta au continut intreaga regiune timpurie a ADN-ului SV40. Daca insa Endo R. Hpal a introdus o ruptura in regiunea timpurie, aceasta a inactivat capacitatea transformanta observata, dovada ca nici o transformare nu a fost constatata la vreunul din cele 3 fragmente testate (Abranams, Mulder, Van de Voorde si altii, 1976).

Studiul reglarii expresiei transcriptiei virale si al expresiei antigenului tumoral (antigenul T) in celulele de soarece 3T3 transformate prin virus simian 40 (SV40) a demonstrat ca in cazul opririi ciclului celular in perioada G1, majoritatea celulelor devin antigen T negative. Inductia proliferarii in cultura determina reaparitia antigenului T in cele mai multe celule, concomitent cu inducerea sintezei ADN. Ratiunea disparitiei antigenului T in celulele oprite in G1 pare sa rezide intr-un control transcriptional care opereaza asupra ADN-ului viral integrat, dovada ca aceste celule contin o neinsemnata cantitate de ARN specific al SV40. In concluzie, transcriptia geno- forului viral SV40 in celulele transformate este dependenta de ciclul celular (Basilico si Zouzias, 1976). Foarte probabil, transformarea prin virus Polioma interfereaza de asemenea si cu diferite conditii care pricinuiesc oprirea ciclului celular in G1 (Stuart Burstin si Basilico, 1975). De asemenea si prin cercetarea expresiei antigenului tumoral in linia celulara T2 de neurosarcom uman s-a constatat o crestere progresiva a expresiei antigenice inceputa in mitoza tardiva si G1 timpurie cu maximum de expresie in G1 medie. Apoi, expresia antigenica decima la nivele minime in S si faza G2 (Burk, Drewinko, Lightiger si Trugillo, 1976). Este important sa mentionam si dovada ca alfafetoproteina (AFP) este sintetizata de la faza G1 tirzie pina la sfirsitul fazei S, timp de 9 ore, in clona C4 a hepatomului AH66 si 25 de ore in clona A1 din acelasi hepatom. Productia de albumina s-a realizat de la faza S tirzie la inceputul fazei G2 timp de 4 ore in C4 si 9 ore in A1, fapt care a reprezentat aproximativ 1/2 sau 1/3 din timp (Tsukada si Hirai, 1975). In privinta relatiei activitatii ADN polimerazei cu stadiile ciclului celular s-a dovedit ca activitatea ADN polimerazei citoplasmatice este fundamental absenta in G0, insa creste remarcabil in celule progresind de la faza G0 la faza S (Barr, Sarin, Sarna si Perry, 1976). In cultura fibroblastelor embrionului de sobolan, adenovirusul oncogen de tip 12 determina o infectie abortiva iar in cultura de HEp2 demonstreaza reproducerea si cauzeaza infectia litica. S-a constatat ca in ambele culturi acest virus cauzeaza in faza stationara timpurie scurtarea ciclului mitotic si a perioadelor sale separate datorita scurtarii stadiului presintetic si stadiului sintezei ADN. Aceasta proprietate a virusului este in concordanta ou capacitatea lui de a stimula proliferarea celulelor infectate si este posibil sa fie una din conditiile necesare pentru dezvoltarea transformarilor maligne (Agheenko si Kogan, 1976). S-a demonstrat insa si faptul ca dupa initierea diviziunii fibroblastelor de embrion de pui infectate cu virusul leucemiei aviare (ALV) si initierea sintezei ARN- ului viral, rata sintezei ARN viral specific este independenta de ciclul celular (Humphries si Coffin, 1976). Din cele aratate pina acum se intelege de ce antigenul tumoral (T) este sintetizat intranuclear unde se si acumuleaza in cantitati mari.

Deoarece intre fractiunea nucleica pentru transformarea neoplazica din genoforui viriomului oncogen si un mic segment nucleic din ADN ancestral (component normal al genomului nuclear) exista omologie de secventa nucleotidica (complementaritate), continutul lor informational nu prezinta deosebiri. Deci, in mod logic, nu pot exista diferente intre antigenul tumoral codificat de gena timpurie a virionului oncogen si proteina (antigenul) controlata de gena complementara din ADN nuclear ancestral, fiind stiut ca aceste doua gene hibrideaza. Aparitia antigenelor tumorale in cancerele nevirotice nu trebuie neaparat considerata ca fiind determinata de un pro virus oncogen, ci o exprimare fenotipica a unor gene nucleare ancestrale derepresate.

Intrucit secventa nucleica anaeroba (ancestrala) din genomul eucariotei nu contine mesajul genetic exprimabil in structuri si functii diferentiate, nu inseamna ca aceasta nu poate codifica proteine care, cu toata structura lor primitiva, poseda totusi un anumit grad de specificitate corespunzatoare stadiului pre embrionar al dezvoltarii ontogenetice. Proteinele enzime ale glicolizei anaerobe, sau unele antigene care apar in ontogeneza timpurie, despre care am amintit mai inainte, controlate de genele ancestrale, constituie dovezi concludente in sprijinul afirmatiei noastre. De asemenea, pe baza metabolismului anaerob in neoplasme este posibila producerea de antigene diferite, cu specificitate de agent (in cazul etiologiei virale) sau cu specificitate de tumoare (in neoplazii provocate cu cancerigene chimice). V. N. Kolmikova si A. M. Eroskina (1959) au descoperit o accentuata inrudire antigenica intre tesutul sarcomatos uman si cel embrionar uman, iar Berceanu si colab. (1966) au dovedit ca leucocitele din leucemia mieloida cronica contin un antigen comun cu leucocitul normal si mieloblastul. Cu ajutorul anticorpilor singelui placentar (al parturientei) a fost detectata prezenta unui antigen leucemic embrionar in celule blaste (imature) leucemice umane, dar care este absent in leucocitele donatorilor sanatosi (Akimova, Eremeev si Viadro, 1976). Aceste constatari, ca de fapt si altele in acest sens inserate in literatura de specialitate, pledeaza impotriva unui rol specific al neoantigenelor tumorale in procesul transformarii neoplazice. Mai mult, pun in evidenta echivalenta informationala dintre genele timpurii ale fractiunii virale oncogene integrate (provirusului) si genele complementare din lantul ADN ancestral, ambele segmente genice producind deci aceleasi antigene.
Dealtfel s~a ridicat problema legaturii dintre neoantigenele celulare aparate dupa infectia virala si oncogeneza. In sensul cel mai strict, neoantigenele nu sint caracteristice celulelor tumorale, unele dintre ele fiind prezente si in celulele nemaligne infectate sau chiar in celulele normale. .. Din aceasta cauza, pina in prezent nu s-a putut trage o concluzie definitiva asupra relatiei    dintre producerea de neoantigene si fenomenul de carcerizare. Se considera ca neoantigenele ar fi produse ale unor gene alterate    sau expresia fenotipica a unor gene normale active numai    in perioada embrionara, depresate ca o consecinta a malignizarii (Prehn, 1967) (Mariana    Gociu, 1975). Un simbure de adevar contine cea de-a doua varianta a ipotezei lui Prehn, deoarece in procesul infim al transformarii maligne nu intervin gene alterate.
Pe baza celor aratate putem sublinia ca fractiunea virala oncogena nu integreaza in genomul celulei gazda o    informatie suplimentara, nu substituie un mesaj fals, nu impune celulei un program nou de sinteza proteica. Numai genele care codifica proteinele structurale ale acestui virion contin o informatie straina genomului celulei gazda (capsida proteica specifica manifesta o reactie caracteristica cu anticorpi specifici), insa aceste gene specifice structurii virionului nu au nici o relatie cu procesul cancerizarii. Genele virale pentru transformarea neoplazica nu infiltreaza in codul genetic al celulei gazda un mesaj ereditar propriu acestei fractiuni, dovada complementaritatea segmentului genic viral oncogen cu un segment din ADN ancestral nuclear. Derepresia genelor ancestrale nucleare nu este efectul unei informatii virale eterogene (deoarece integrarea acesteia in genormul nuclear nu poate avea loc in lipsa unei omologii de secventa nucleotidica), ci al dezorganizarii sistemului aerob si al inexprimarii genice nucleare specifice.